【摘要】 晚期乳腺癌预后较差，疾病特征复杂，后线解救治疗较为困难，但是通过选择有效的治疗方案，部分患者可以实现长期带瘤生存，获得较好的生存质量。近年来，随着分子生物学和基因检测技术的飞速发展，晚期乳腺癌相关研究不断深入，治疗手段不断丰富，基因靶向治疗使晚期乳腺癌患者生存期显著延长。基因检测是分子分型诊断、遗传风险预测、疗效监测、耐药提示以及治疗方案选择的重要手段，对晚期乳腺癌患者的分子病理诊断、靶向药物选择以及治疗模式优化具有重要意义。共识专家委员会基于循证医学证据，归纳晚期乳腺癌基因检测的热点问题，深入探讨晚期乳腺癌基因检测的适用人群和临床意义、不同分子分型患者的检测基因和分子标志物、循环肿瘤DNA、全外显子基因检测的应用，总结规范二代测序技术在临床中使用的注意事项，指导临床医师合理应用基因检测，为晚期乳腺癌患者提供更全面的基因检测信息，从而制定更精准的治疗策略。 【关键词】乳腺肿瘤；基因检测；专家共识
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，2020年全球新发乳腺癌病例约230万，发病率居全部恶性肿瘤首位。据统计，早期乳腺癌接受手术治疗后，仍有30%～50%的患者最终出现局部复发和远处转移，除此之外，约有4%～６%的乳腺癌患者在首次诊断时即存在远处转移。复发转移性乳腺癌也称为晚期乳腺癌，该类患者5年生存率仅为20%，总体中位生存时间为2～3年。近年来，晚期乳腺癌的临床治疗面临巨大挑战，不同类型的晚期乳腺癌应以分子靶向药物治疗为核心开展精准打击，进一步实现精准医疗。二代测序技术（next generation sequencing， NGS）是精准医疗领域的关键技术，具有通量高、灵敏度高、成本低等优势，是乳腺肿瘤分子分型、遗传诊断、疗效监测、耐药提示以及治疗方案选择的重要手段。本共识就晚期乳腺癌基因检测的临床应用及检测技术相关的热点问题进行深入探讨。
1. 晚期乳腺癌基因检测的适用人群和临床意义
晚期乳腺癌难以治愈，其治疗的主要目的为通过优化治疗模式、实施个体化治疗来延长患者生存时间，提高生活质量。近年来，乳腺癌分子靶向药物不断出现，包括靶向雌、孕激素受体的内分泌治疗药物、靶向人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor-2, HER-2）的药物、PI3K信号通路抑制剂、抗血管生成药物、靶向乳癌易感基因（breast cancer susceptibility gene， BRCA）1/2突变的多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymeRASe， PARP）抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase， CDK）4/6抑制剂和免疫检查点抑制剂等。晚期乳腺癌患者肿瘤或胚系的基因突变信息可以辅助临床医师对肿瘤患者进行精准分型和治疗靶点的精确定位，提示药物敏感和耐药，有助于治疗策略制定和临床药物选择。对在药物治疗过程中出现疾病进展的患者再次进行基因检测，有助于临床医师对患者采取更精准的治疗措施。2020年8月，欧洲肿瘤医学学会发布了全球首个转移性恶性肿瘤患者NGS指南，强烈建议临床研究中心在晚期肿瘤的分子筛选过程进行多基因测序，增加患者使用新药物的机会并加速临床研究。SAFIR01和UNICANCER研究是一项利用比较基因组杂交阵列及DNA测序指导晚期乳腺癌精准治疗的研究，结果显示，46%（195/423）的患者存在潜在靶向药物的基因组突变，在46例可评估并接受靶向治疗的患者中，9%有客观反应，21%病情稳定超过16周。基于乳腺癌临床实践及药物研发现状，推荐经济条件允许、病理标本可及的晚期乳腺癌患者进行全面的基因检测。不同分子亚型晚期乳腺癌患者基因突变特征有共性也有特性，本文将根据不同分子分型介绍晚期乳腺癌的基因检测。
对于经济条件允许、病理标本可及的晚期乳腺癌患者进行全面的基因检测，尤其是对于标准治疗后出现疾病进展的患者，基因检测可以作为临床策略的一部分，有助于临床医师对患者采取更精准的治疗措施，为患者提供更多的治疗机会。
2. 激素受体（hormone receptor, HR）阳性患者应该进行哪些基因和生物标志物的检测
HR阳性乳腺癌是指雌激素受体（estrogen receptor， ER）、孕激素受体（progesterone receptor， PR）中至少1种受体为阳性的乳腺癌患者，约占全部乳腺癌患者的70%以上。对于HR阳性的晚期乳腺癌患者，内分泌治疗为主要治疗手段，但是几乎所有的内分泌治疗在数年后都会发生耐药，主要的耐药机制包括雌激素受体α基因（estrogen receptor alpha gene， ESR1）的获得性突变、CDK4/6的组成性激活、PI3K/AKT/mTOR信号通路激活等。
体外研究表明，CYP2D5基因功能缺失突变、ESR1获得性突变、ER及其信号相关通路异常活化均与内分泌治疗耐药有关。30%的HR阳性转移性乳腺癌患者中，ESR1编码的ER结合结构域可能存在激活突变，并且，ESR1突变型乳腺癌可能会对内分泌治疗产生抵抗，对靶向治疗的反应较好。在内分泌药物选择方面，对于具有ESR1突变的HR阳性晚期乳腺癌患者，含氟维司群方案明显优于依西美坦单药方案，患者的无进展生存时间（progression-free survival， PFS）显著延长。对于芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitor, AI）治疗后进展的HR阳性HER-2阴性乳腺癌患者，约为40%存在PIK3CA基因突变。Ⅲ期临床研究BELLE-2和SOLAR-1显示，PIK3CA突变患者应用氟维司群联合PI3KCA抑制剂可显著获益（BELLE-2研究中，氟维司群联合Buparlisib和氟维司群联合安慰剂组患者中位PFS分别为6.8和4.0个月；SOLAR-1研究中，氟维司群联合Alpelisib和氟维司群联合安慰剂组患者中位PFS分别为11.0和5.7个月）。因此，对于HR阳性HER-2阴性的绝经后乳腺癌患者，建议检测PI3KCA突变状态进一步指导治疗。CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗已成为HR阳性患者的一线优选方案。Cyclin D-CDK4/6-INK-Rb通路异常则可能与CDK4/6抑制剂耐药相关，一项大规模转移性乳腺癌体细胞突变研究显示，在HR阳性HER-2阴性转移性乳腺癌患者中，TP53/ target=_blank class=infotextkey>P53、ESR1、GATA3、KMT2C、NCOR1、AKT1、NF1、RB1突变率较高，可能与潜在耐药有关。CYP2D6基因是细胞色素酶P450家族的一种重要代谢酶。研究显示，CYP2D6基因多态性可以指导Tamoxifen/ target=_blank class=infotextkey>他莫昔芬用药，CYP2D6*10 T/T基因型患者的Tamoxifen/ target=_blank class=infotextkey>他莫昔芬活性代谢产物4-羟-N-去甲基他莫昔芬的血浆浓度显著降低，具有更差的临床结局。一项针对中国人群的研究显示，在CYP2D6*10 T/T基因型患者中，接受托瑞米芬辅助治疗患者的5年无病生存时间（disease-free survival， DFS）显著优于他莫昔芬组（分别为90.9%和67.9%，P=0.031）。有研究表明，对于Luminal A型乳腺癌患者，rs6484711多态性调节ABTB2表达可以预测表柔比星为基础的新辅助化疗疗效。这些结果为基因变异在个体化化疗中的潜在作用提供了有价值的信息。成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor, FGFR）是分布广泛的跨膜酪氨酸激酶受体，乳腺癌中常发生其通路异常。有研究报道，约19%的ER阳性患者携带FGFR1突变，FGFR抑制剂治疗FGFR1/2/3扩增的ER阳性HER-2阴性转移性乳腺癌的疗效显著。PARP抑制剂奥拉帕利和他拉唑帕尼对BRCA1/2或PALB2突变晚期乳腺癌患者有较高的临床反应率（＞60%）。程序性死亡受体1（programmed cell death-1, PD-1）抑制剂（帕博利珠单抗）治疗微卫星高度不稳定性（microsatellite instability high， MSI-H）的实体肿瘤和NTRK抑制剂（恩曲替尼）治疗NTRK融合的实体肿瘤，均已获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准，HR阳性晚期乳腺癌也可能存在MSI-H和NTRK融合的特征。
HR阳性晚期乳腺癌患者主要以内分泌治疗和靶向治疗为主。对于HR阳性患者，需要关注内分泌治疗耐药相关基因突变（ESR1、CYP2D6、CyclinD-CDK4/6-INK-Rb通路、PI3K/AKT/mTOR通路等），患者可根据基因检测选择可能获益的药物如氟维司群、托瑞米芬、PI3K抑制剂、mTOR抑制剂、奥拉帕利（BRCA1/2）、FGFR抑制剂（FGFR1/2/3）、帕博利珠单抗（PD-1）、恩曲替尼（NTRK融合）。
3. HER-2阳性乳腺癌的患者应该进行哪些基因和生物标志物检测
HER-2阳性乳腺癌约占全部乳腺癌患者的20%以上。目前，抗HER-2单抗、小分子酪氨酸激酶抑制剂及抗体偶联药物的升级逐步提升了HER-2阳性患者的治疗效果。然而，晚期患者仍然进展较快，较易出现耐药。有研究表明，HER-2基因突变可能是导致HER-2阳性乳腺癌患者原发或继发耐药的原因，其潜在耐药机制包括不完全阻断HER-2受体，激活HER家族内的代偿机制（HER-3），激活替代受体酪氨酸激酶（IGF-1R、MET），过度激活HER-2下游信号级联（PI3K/AKT/mTOR通路）和抑制肿瘤抑制基因（PTEN），其他下游信号级联激活包括ER和HER-2与细胞周期蛋白Cyclin D1-CDK4/Rb轴之间的双向调控。一项Ⅰ期研究结果显示，阿培利司和T-DM1联合治疗在曲妥珠单抗耐药的HER-2阳性晚期乳腺癌患者中安全性和有效性较好，客观缓解率（objective response rate， ORR）为43%，中位PFS为8.1个月。另外，PANACEA研究中，学者评估了HER-2阳性晚期乳腺癌接受帕博利珠单抗联合曲妥珠单抗的疗效，程序性死亡受体配体1（programmed cell death-ligand 1, PD-L1）阳性患者的ORR更优（15%）。因此，对于PD-L1阳性、曲妥珠单抗耐药的HER-2阳性晚期乳腺癌患者，帕博利珠单抗可能作为治疗选择之一。另有研究表明，液态活检可以动态判断肿瘤基因组的异质性，而循环肿瘤DNA可能预测吡咯替尼治疗HER-2阳性晚期乳腺癌患者的疗效。
HER-2阳性晚期乳腺癌患者需检测HER-2突变状态以协助选择后线治疗药物。全面评估HER-3、MET、PTEN及PI3K/AKT/mTOR等耐药相关基因突变及PD-L1蛋白表达情况，可辅助HER-2通路以外的临床方案制定，如PIK3CA抑制剂或免疫检查点抑制剂治疗。
4. 三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）应该进行哪些基因和生物标志物的检测
TNBC约占全部乳腺癌的15%～20%，是临床预后较差的一个亚型，是精准靶向治疗的重点和难点。目前，TNBC潜在的治疗靶点有PI3K/AKT/mTOR、BRCA1/2、FGFR1/2/3等。约10%～15%的TNBC存在胚系或体系BRCA1/2突变，对于铂类化疗以及PARP抑制剂显示出更高的疗效。Ⅲ期临床试验OlympiAD结果显示，对于胚系BRCA1/2突变的晚期TNBC，奥拉帕利较化疗能够降低57%的疾病进展或死亡风险（HR=0.43，95% CI：0.29～0.63）。在LOTUS研究中，学者通过NGS检测发现，41%（42/103）的TNBC携带PIK3CA/AKT1/PTEN通路相关突变，此类患者增加PIK3CA抑制剂Ipatasertib有显著获益。FUTURE研究中，学者通过对晚期耐药性TNBC进行全面的基因检测，结果显示，难治性TNBC中最常见的突变基因包括TP53（72%）、PIK3CA（18%）、PTEN（10%）、KMT2D（9%）和TSC2（9%），其中对于富含HER-2基因突变的晚期TNBC患者，接受吡咯替尼联合卡培他滨治疗可能获益；免疫调节型晚期TNBC患者接受卡瑞丽珠单抗联合白蛋白紫杉醇显示出良好疗效，ORR可达到52.6%。化疗方面，有研究表明，DNA氧化损伤相关的碱基切除修复通路单核苷酸多态性突变（如PARP2基因rs878156）患者对蒽环类化疗药物敏感，生存时间延长。
化疗是TNBC患者最主要的治疗方式，通过评估胚系单核苷酸多态性如DNA氧化损伤相关的碱基切除修复通路为TNBC患者选择敏感的化疗药物。TNBC患者BRCA1/2、PIK3CA/AKT1/PTEN通路等基因突变频率较高，且可相应选择PARP抑制剂、AKT抑制剂等靶向治疗和免疫检查点抑制剂的治疗。
近年来，免疫治疗已成为晚期乳腺癌治疗领域中最具前景的治疗方式之一。DNA错配修复（mismatch repair， MMR）缺失、MSI-H和高肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB，≥10 Muts/MB）作为免疫治疗分子标志物也相继获批用于治疗无替代治疗方案的晚期实体瘤患者。免疫单药治疗晚期转移性TNBC，PD-L1阳性表达的患者ORR为4%～23%，优于PD-L1阴性亚组。KEYNOTE-355研究显示，在晚期转移TNBC PD-L1阳性患者中，一线应用帕博利珠单抗联合化疗与单独化疗相比，总生存时间得到了显著和有临床意义的改善。此外，多种肿瘤免疫治疗过程中存在免疫超进展和免疫耐药的情况，因此，还应该关注相关基因（EGFR、MDM2/4等、JAK1/2、B2M等）突变情况。对于需要进行免疫治疗的晚期乳腺癌患者，需要全面评估肿瘤的免疫治疗相关生物标志物和潜在受益或风险标志物（表1）。
晚期乳腺癌患者进行全面的免疫相关标志物评估，包括PD-L1表达、MSI/MMR、TMB等，同时也需关注免疫超进展和免疫耐药相关基因的检测，如EGFR、MDM2/4等、JAK1/2、B2M等。
6. 晚期乳腺癌患者是否需要循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)检测及其临床应用
ctDNA由肿瘤细胞和循环肿瘤细胞等凋亡、坏死后释放到血管中的游离DNA片段组成，其检测具有敏感性、均质性、实时性等优点，在肿瘤的复发预测、耐药监测及用药指导方面具有重要意义。基于组织的NGS是获得肿瘤突变信息的金标准技术，然而，ctDNA作为非侵入性基因检测方式成为组织不可及的晚期乳腺癌基因检测的替代方法。近年来，利用ctDNA进行基因组分析在晚期乳腺癌患者的个性化治疗中发展迅速。plasmaMATCH研究显示，在晚期乳腺癌中，ctDNA检测结果可靠（和组织活检结果相比准确率达到98%），并可根据ctDNA的特定突变指导患者匹配相应治疗，HER-2突变和AKT1突变患者接受匹配的治疗的疾病缓解率分别为25%（5/20）和22%（4/18）。有研究显示，ctDNA比蛋白指标和影像学更灵敏，可提前3～6个月发现晚期乳腺癌肿瘤的扩散和复发。2020年8月，FDA批准首个基于NGS的液体活检伴随诊断产品上市，用于泛实体瘤的全面基因组分析，NCCN乳腺癌指南也对ctDNA检测进行了推荐。
ctDNA检测作为重要的液态活检技术，作为组织检测的替代方法可有效评估晚期乳腺癌的肿瘤突变负荷和分子特征，对解决临床检测取样困难、克服肿瘤异质性、选择有效治疗方法及用药动态监测等均具有一定的临床应用价值。
7. 晚期乳腺癌患者是否需要进行全外显子基因检测
全外显子组测序（whole exome sequencing， WES）可反映全部编码区基因突变的情况。对于科研探索，WES可提供更全面的肿瘤突变特征和上下游信号通路信息，辅助发现靶向耐药机制，及时提示新的靶向药物敏感位点，为晚期乳腺癌研究提供更加全面和重要的信息。目前临床常见的检测包含几十至几百个基因，根据已明确的跟肿瘤发生发展密切相关的基因设计靶向测序，性价比更高，更具可及性。以TMB检测为例，基于WES的回顾性研究显示，TMB水平高的患者在抗CTLA-4和PD-L1治疗后，肿瘤缓解和生存获益更优。WES是TMB计算的金标准，有研究证明，基于大panel（编码区≥0.8 Mb）检测计算的TMB具有与WES高度的一致性。目前多基因检测能够基本满足晚期乳腺癌患者的用药和诊疗需求，WES能够进一步满足临床科研探索和数据挖掘。
WES可全面高效地了解肿瘤患者的疾病全貌，在肿瘤发病机理及上下游信号通路信息等方面为科研探索提供重要信息。500个基因以上基因检测基本可满足患者精准的用药指导、耐药机制等信息需求，可作为一般患者的替代选择。
8. 晚期乳腺癌NGS可选择哪些标本以及不同来源标本如何优选
根据检测目的可以选择体系突变检测和胚系突变检测。体系突变检测一般采用手术切除或穿刺组织（甲醛固定和石蜡包埋组织切片）、血液、胸腹水以及脑脊液来进行检测；胚系突变检测则一般采用血液进行检测，还可选择唾液、口腔拭子（口腔上皮细胞）等样本。晚期乳腺癌患者在基因检测时尽量选用手术或穿刺新鲜组织（如肿瘤组织不可及，可以考虑血浆ctDNA、胸腹水及脑脊液）。不同样本要求详见表2。为保证胚系突变能够精准过滤，在基因检测时最好提供外周血进行白细胞对照，以获得准确的肿瘤细胞特有突变。
晚期乳腺癌患者基因检测，优先选择对新鲜组织进行检测，如组织不可及可考虑石蜡包埋组织切片、血浆、胸腹水等。为保证肿瘤突变特异性检出，在基因检测时最好提供外周血白细胞进行对照。
9. NGS检测公司众多检测流程复杂，如何选择可信的NGS检测
2014年，《关于开展高通量基因测序技术临床应用试点单位申报工作的通知》（国卫医医护便函［2014］44号）的颁布标志着我国正式启动了对NGS临床检测工作的监管。可信的NGS检测平台应具有完整的样本处理和检测、生信分析、突变解读及临床检测报告出具全流程体系及按照美国病理学会（College of American Pathologists， CAP）、ISO15189准则等国际标准搭建的实验室质量管理体系。二代测序试剂盒和标准品应选择国家药品监督管理局认可的产品，实验试剂以及实验流程要有严格的试剂标准操作规程。测序机构应选择通过国内外各项机构［国家卫生健康委员会临检中心（National Center for Clinical Laboratories， NCCL）、CAP和欧盟分子遗传实验质控网（European Molecular Genetics Quality Network， EMQN）］认证的、室间质评合格的平台。突变解读标准和规范可参照《美国医学遗传学与基因组学学会及美国分子病理学会序列突变解读标准和指南》、《美国分子病理学会、美国临床肿瘤学会及美国病理学协会癌症序列突变解读和报告的标准和指南（2017版）》和《BRCA数据解读中国专家共识》。
目前，我国还没有建立起完善的基因检测公司技术标准及市场准入标准，正规的基因检测机构应具有《医疗机构执业许可证》、《医疗器械生产许可证》及《医疗器械经营许可证》等相关资质认证。
基因检测应选择资质齐全、技术实力雄厚、后续服务能力强的正规基因检测机构，检测机构的各项检测流程需通过NCCL、EMQN和CAP等机构认证，确保检测结果准确。
10. 常用的NGS基因检测数据库是否适用于中国人群
在生物信息学分析和遗传解读过程中，应使用基因-人群数据库、基因-疾病和基因-药物关联性数据库等（表3），这些数据库是以西方人群为主建立的，由于基因多样性，不同种族的基因突变可能不同，这些数据库类型不一定适合中国人群。根据国际抗癌联盟《国际癌症杂志》研究报告显示，中国遗传性乳腺癌和卵巢癌患者的胚系BRCA1/2突变具有高度的种族特异性。也有研究表明，中外乳腺癌突变谱差异主要集中在HR阴性HER-2阴性型中，中国乳腺癌患者具有独特的胚系突变特征，并显著影响肿瘤的临床特征和分子特征。亚洲乳腺癌合作小组通过对多组研究数据进行分析，发现患有乳腺癌的绝经前亚洲妇女有着独特的疾病特征，并可能受益于与国际指南略有不同的治疗。
目前国内研究者在疾病数据分析中使用的是国际通用数据库（如ClinVar、COSMIC、OncoKB），这类数据库多为国外研究机构创建，样本多来源于西方人群。中西方不同人群间存在基因差异，国际通用数据库用于中国人群的疾病分析缺乏针对性，结果的参考意义在一定程度上受到影响。
基于NGS的精准医疗正在成为医疗领域的新模式，随着对晚期乳腺癌认识的不断加深，合理应用基因检测，对于晚期乳腺癌患者的疗效预测、预后评估及耐药机制的探索将会发挥更加重要的作用。
